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本试剂盒是用来检测细胞活性和细胞功能，有很多指标都能检测细胞活性，本试剂盒使用一种特制的染料，一旦进入活细胞中，其荧光强度增强。这种染料是一种疏水性复合物，可以轻易地进入完整的活细胞。通过细胞内酯酶水解弱荧光性底物，产生具有强烈荧光的亲水性产物，并且可以在保持在细胞质中。这种酯酶的活性与活细胞数量成比例关系，因此酯酶水解荧光底物形成的产物的荧光强度与活细胞数量相关。生长在培养板中的细胞可以被染料，且在不到两小时内就可以完成定量分析。本检测法比四唑盐或者基于Alarmar Blue的检测更加强大、稳定。它可以用于许多荧光实验平台的高通量分析中，例如微孔板分析，荧光显微镜分析和流式细胞术。它在许多研究中非常有用，包括细胞粘附性、趋化作用、药物抗性、细胞活性、细胞凋亡和细胞毒性研究。本试剂盒提供所有必需组分和最佳检测方案。它适合于增殖型和非增殖型细胞，也可用于悬浮和贴壁细胞。

组分	规格
组分A：Violet 450,AM	5支
组分B：DMSO	200μL
组分C：Assay Buffer	50mL

保存：-20℃，避光。


使用前，请将该试剂盒的所有组份在室温解冻。

• 向具有黑色的壁和透亮底部的微型细胞培养板中每孔加入每毫升100到10000个浓度的细胞，每孔添加测试化合物，在37℃，5% CO₂细胞培养箱中孵育所需要的时间（如24小时、48小时或96小时）。未加细胞的空白对照，加入相同量的化合物，建议96孔板中每孔总体积100μL，384细胞微量板中加入25μL。
  
  • 最佳细胞浓度是根据测试细胞增殖或是细胞毒性的目的不同而不同，对于细胞增殖，要求添加较低浓度细胞，对于细胞毒性检测，要求开始添加较高浓度的细胞。
• 添加20μL DMSO至一支CytoCalcein Violet 450,AM（组分A）中，充分混匀。
  
  • 20μL体积溶解的CytoCalcein Violet 450,AM可以足够一个板用，未用的CytoCalcein Violet 450,AM溶液储存于密闭的管子里，低于-20℃冷冻，避光，可保存一个月，期间应避免重复冻融。
• 把总体积20μL CytoCalcein Violet 450,AM全部加入10mL Assay Buffer(组分C)中，充分混匀，此染色工作液室温下能稳定保存2个小时。
  
  • 假如处理的是CHO细胞，由于其富含阴离子转运蛋白，随着时间的变化，能导致染料荧光性变弱。所以向工作溶液里加入羧苯磺丙胺溶液，配置成终工作浓度1到2.5mM，羧苯磺丙胺溶液分装并保存于- 20℃。
• 用所需要的药物处理细胞（步骤1）
  
  • 添加化合物之前没必要洗涤细胞，然而，如果被测物是血清敏感性的，在添加药品之前，必须去除培养基中血清成分，96孔板中每孔加入100μL，384微孔板每孔加入25μL含20mM Hepes的Hanks缓冲液(HHBS)或其他缓冲液，最终，保证细胞生长在无血清的培养基中。
• 往96孔板中每孔加入100μL，384微孔板每孔加入25μL配制的染色工作液。
  
• 添加染料缓冲液后，室温或37℃，避光孵育一个小时，（孵育时间可以从15分钟到过夜，我们得到最佳的孵育时间是少于4个小时）
  
  • 最佳孵育时间是根据细胞类型和细胞浓度确定，每个实验要优化下孵育时间；加完染料缓冲液后禁止洗涤细胞；对于悬浮细胞，孵育后要800rpm，离心2分钟。
• 测定和计算每孔的荧光度比值Ex/Em = 405/460nm。

背景值是加入药物处理细胞的吸光值减去无细胞空白孔值相减所得，空白孔背景值随着细胞板材质和培养基的不同而不同。

图1．CHO-K1细胞数目的响应值就是用Cell Viability Test Kit所测，使用柯仕达厂家的黑色侧壁透明底部的96孔细胞培养板，每孔总体积100μL，设置每孔0到5000个细胞梯度并加入测试试剂，过夜培养。加入组分A每孔100μL，室温孵育1小时。光吸收酶标仪分别测算出405nm和460nm处的吸光值比值，如图所示，细胞数目和其荧光强度是线性关系（相对系数=1），最低检测限，每孔70个细胞（n=6）。
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